Cancer Discovery I 10x 单细胞测序联合Akoya单细胞原位蛋白组分析探索胃癌患者标准化疗不敏感原因
胃癌是世界上第五大常见恶性肿瘤，并且在癌症导致死亡的癌种中排第三名。化疗是常见的一线胃癌治疗方案，但不同的患者对化疗的反应差别很大，其中原因目前并不清楚。此前，有大量研究围绕胃癌的基因组、转录组、单细胞水平转录组和空间原位肿瘤免疫微环境展开。
在Cancer Discovery杂志4月刊上，来自韩国成均馆大学的研究人员发表的题为“Early Tumor–Immune Microenvironmental Remodeling and Response to First-Line Fluoropyrimidine and Platinum Chemotherapy in Advanced Gastric Cancer”的文章中，研究团队使用采用一线化疗药物治疗前和治疗中的进展期胃癌（AGC）患者样本，联合全外显子组测序（WES）、全转录组测序（WTS）、10x Genomics单细胞转录组测序（sc-RNAseq）与PhenoCycler（原Codex）单细胞原位空间组学技术研究胃癌患者在化疗前后肿瘤免疫微环境（TME）的变化情况。
文章首先纳入了12例初始化疗AGC患者，先通过这些患者的12个治疗前肿瘤样本和6个化疗中样本进行WES，并将测序结果对比TCGA数据库，发现了2例遗传性胃癌和其他癌症相关突变。通过WES发现，这些患者在基于铂的化疗治疗前和治疗中，癌症相关突变未发现明显变化，表明这些癌症相关基因与化疗前后肿瘤免疫微环境变化无显著影响。
随后，研究人员对这12例患者的治疗前后样本进行WTS。研究未发现转录组水平上化疗敏感患者样本和不敏感患者样本的明显变化。而一些经典的通路上的基因在化疗前和化疗中表达水平产生明显差异。如M2型巨噬细胞在治疗中明显被抑制，表明在传统化疗治疗中，M1/M2复极化；PD-1通路在治疗过的ACG患者中显著活化，暗示铂相关化疗重现肿瘤免疫微环境。化疗中的ACG患者中，对化疗敏感的患者的PD-1通路和炎症相关因子的表达增高，而对化疗不敏感的患者样本中的WNT通路表达增高，并且可能因此其可能限制了T细胞浸润。
文章还对11例治疗前样本和7例治疗中样本进行10x单细胞测序。对测序结果分析发现，治疗中的患者样本的T细胞比例有增加趋势，特别是在Her2阴性的ACG患者中；对化疗治疗敏感的患者的治疗中样本与治疗前相比CD8细胞比例更高；而不敏感患者的耗竭型T细胞的比例更高；与对化疗敏感的患者相比，不敏感的患者的肿瘤相关巨噬细胞比例更高，并且其比例在治疗过程中增加。为了进一步研究T细胞数量和肿瘤免疫微环境变化的原因，作者研究了上皮细胞中的免疫信号通路，发现化疗后损伤相关分子模型家族的表达上升；先天性免疫相关基因的表达也有所上升。表明在某些亚型的患者中，传统化疗通过重建T细胞区室和诱导先天性免疫来促进抗肿瘤炎症反应。
作者基于以上研究结果，推断在化疗过程中，抗原呈递细胞对TME重建和T细胞招募发挥重要作用。作者将样本中的淋巴细胞分成五个亚型，并聚焦于肿瘤相关巨噬细胞，发现其中的促炎症相关基因在化疗中表达显著增加，同时抗炎症相关基因表达显著下降。联合WTS结果确认M2型巨噬细胞在化疗中数量显著减少。而与淋巴细胞分化，抗原呈递和MHC1肽段组装相关的基因在化疗中表达增加。这些变化与化疗介导的巨噬细胞调整一致。为了更好地了解化疗过程中巨噬细胞表型的重构，作者还进一步研究了TAM的分化轨迹，发现在化疗过程中，CD8+淋巴细胞浸润和CD68+巨噬细胞数量显著增加。然而CD68不能很好得区分巨噬细胞的类型。
为了更好得理解耗竭型T细胞的空间分布，作者构建了19个标记物的抗体panal进行PhenoCycler单细胞原位空间组学分析。
首先选择了MET扩增的AGC患者的治疗前和治疗中样本进行检测，该患者在两轮XELOX治疗后迅速进展。PhenoCycler结果显示，化疗前在肿瘤基线附近含有大量CD11c+ DC细胞，CD8+淋巴细胞；在两轮化疗后，肿瘤免疫微环境中免疫浸润区域以巨噬细胞，肿瘤细胞和CD20+B细胞为主。另一名疾病进展的患者也进行了PhenoCycler检测，发现该患者化疗中相比化疗前LAG3+和CD20+细胞数目增加。在两名AGC初级进展的患者中，10x单细胞测序和超多重免疫荧光检测均发现了LAG3蛋白表达增加。LAG3+ T细胞数目增加仅出现在化疗不敏感的患者化疗过程中。
该文章为初次治疗AGC患者提供了一个初步的验证数据集，帮助建立了一个AGC的肿瘤免疫微环境的详细图谱，包含了转录组水平和蛋白水平的数据。文章证明了对治疗中样本进行研究的可行性，并且对AGC患者化疗对不同类型患者免疫微环境的影响进行了研究及对化疗不敏感原因进行了研究。
本文通过外显子水平、转录组水平、单细胞转录水平和空间原位超多靶标蛋白水平对AGC患者化疗前和化疗中样本进行了检测，通过方法学之间的联合和相互验证完善了作者的假设，展现了肿瘤免疫微环境研究中多组学连用的优势。
参考文献
1. Early Tumor-Immune Microenvironmental Remodeling and Response to First-Line Fluoropyrimidine and Platinum Chemotherapy in Advanced Gastric Cancer. Cancer Discov. 2022 Apr 1;12(4):984-1001.
