10x Genomics助力骨肉瘤异质性及免疫微环境的解析
文章题目：Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma
文章期刊：Nature Communications
影响因子：12.121
发表时间：2020年12月
—— 文章摘要 ——
骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，预后较差。本研究通过对来自7个原发性，2个复发性和2个肺转移性骨肉瘤病变的100,987个单个细胞利用10x Genomics单细胞转录组技术，进行RNA测序，基于基因表达谱和典型标记的无偏聚类，鉴定出11个主要细胞亚群。表征了骨肉瘤恶性细胞的转录组学性质，调控因子和动力学以及它们的肿瘤微环境，特别是基质细胞和免疫细胞。通过分析推断的拷贝数变化和轨迹揭示了恶性成骨型细胞从恶性软骨细胞的转分化。在肺转移性骨肉瘤病变中发现促炎性FABP4 +巨噬细胞浸润。与原发性成骨性骨肉瘤病变相比，在成软骨细胞，复发性和肺转移性骨肉瘤病变中观察到较低的破骨细胞浸润。重要的是，TIGIT阻滞增强了原发性CD3 + T细胞的细胞毒性作用，其中TIGIT +细胞的比例很高，可抵抗骨肉瘤。本文绘制了单细胞图谱，探讨了肿瘤内异质性，并为骨肉瘤提供了潜在的治疗靶标。
—— 研究结果 ——
①-骨肉瘤的细胞组成
在本研究中，通过10x Genomics单细胞测序技术获得100,987个单细胞的转录组信息，分成了11种主要细胞类型，包括成骨细胞型骨肉瘤细胞、增殖期成骨细胞型骨肉瘤细胞、软骨母细胞型骨肉瘤细胞、破骨细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL，包括T细胞和NK细胞）、髓系细胞、成纤维细胞、间充质干细胞（MSCs）、周细胞、成肌细胞和内皮细胞。
②-骨肉瘤的恶性细胞异质性
本研究系统分析骨肉瘤恶性细胞异质性，进一步将恶性细胞细分为7个亚群，其中6个亚群为成骨细胞型骨肉瘤细胞，1个亚群为软骨母细胞型骨肉瘤细胞。
通过GSEA及GO富集分析，揭示了各细胞亚型转录组涉及的信号通路特征，发现与成骨细胞型骨肉瘤相比，软骨母细胞型骨肉瘤恶性细胞高表达与软骨细胞分化、胶原纤维形成、软骨发育相关的基因。
利用inferCNV 算法分析了恶性细胞的拷贝数变异（CNVs）特征，并基于此数据研究不同恶性细胞亚型之间的克隆进化关系，发现恶性成骨细胞可能是由恶性软骨母细胞分化而来。
通过Monocle 2 和Slingshot 算法进行拟时轨迹分析，发现软骨母细胞可分化为成骨细胞和软骨内成骨，并且在软骨母细胞分化过程中，不仅高表达与成骨细胞分化、成骨和骨形态发生相关的基因，而且高表达与组蛋白甲基化和乙酰化相关的基因。这些结果再次显示，表观遗传修饰可能在很大程度上促进了恶性软骨母细胞向恶性成骨细胞的分化。
③-其他细胞类型特征
研究人员还分析了骨肉瘤中破骨细胞、间充质干细胞以及成纤维细胞在不同病变组织中的细胞转录特性、调控因子及动力学特征。破骨细胞在骨溶解和肿瘤生长支持中起着重要作用，间充质干细胞可能会刺激肿瘤细胞的增殖、转移和耐药性，成纤维细胞也与骨肉瘤的疾病特征密切相关。
④-骨肉瘤的免疫微环境
肿瘤免疫微环境对疾病的发生发展起着至关重要的作用。细分组织中的髓系细胞得到10个不同的细胞亚群，包括单核细胞、TAMs、DC和中性粒细胞等，单核细胞和巨噬细胞占病变组织中髓系细胞总数的70-80%。细分骨肉瘤相关巨噬细胞（TAMs）群体得到3个细胞亚型，其中占比最多的是M2型TAMs，并在肺转移癌灶组织中发现了促炎性FABP4+巨噬细胞。TILs细胞被细分为8个亚型，包括CD4−CD8−T细胞、 CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、T-reg细胞、增殖性T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞。与原发病灶相比，肺转移和复发病灶中T细胞介导的肿瘤抑制活性较弱。CD8+ T细胞高表达T细胞耗竭抑制性受体基因TIGIT 和 LAG3，提示肿瘤中CD8+T细胞在初始激活阶段后迅速耗竭。此外，数据显示TIGIT还在T-reg细胞、CD4+T细胞和NKT细胞中广泛表达，提示骨肉瘤患者有可能受益于TIGIT阻断治疗。近年来，抗TIGIT药物通过调节CD8+T细胞、T-reg细胞和NK细胞的活性，在治疗结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤方面起到积极作用。本项目中研究人员分别提取高表达和低表达TIGIT的肿瘤浸润CD3+T细胞，利用抗TIGIT抗体在体外共培养体系中检测两种CD3+T细胞对骨肉瘤恶性细胞的细胞毒力。结果表明，阻断TIGIT信号可显著增强高表达TIGIT的CD3+T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤率，提示靶向TIGIT治疗对骨肉瘤有潜在的治疗价值。
