实验贴士 | PhenoImager多重荧光免疫组化方案开发快速指南

随着肿瘤免疫治疗成为肿瘤治疗的重要手段，PhenoImager多重荧光免疫组化的多光谱成像作为分析平台也正日趋成熟，已成为肿瘤免疫研究常用的工具。多重荧光免疫组化技术的染色原理和免疫组化IHC非常接近，而实际实验过程中又充满了挑战。如何快速建立一个适合于自己课题的多重荧光免疫组化标志物组合呢？

适用于多重荧光免疫组化的抗体需要具有高灵敏度及特异性，从大量抗体中快速找到这些抗体并非易事。商品化的含一抗组合的Opal 多重荧光免疫组化试剂盒中，包含了免疫细胞的常用分型组合，筛选了已优化的一抗，并将其与适合的荧光染料进行了匹配。参考试剂盒使用说明书进行操作，根据样本具体特点进行简单优化即可。

在转化医学、临床研究方向上，设计方案可以参考经典方法学文献、高影响力研究文章中所使用的标志物组合、抗体克隆、抗原修复条件、染料匹配等详细信息，降低方案设计难度。如下表即Parra等作者列出的详细9色方案的开发实验条件，适合多重荧光免疫组化新手参考，也可以在这个方案基础上进行个性化方案修改。这都将大幅节省实验初期验证和优化的时间。

结合课题，整理出需要探索的科学问题，确定需要哪些蛋白标志物。确定是否需要区分细胞表型和组织结构？是否需要对于某一细胞表型进行更精细的亚型分型？是否需要研究细胞之间的互作关系等等。这些问题可以帮助大家初步确定需要检测的标志物。

PhenoImager多重荧光免疫组化评估2期随机临床试验(NCT03158129)非小细胞肺癌治疗前后肿瘤微环境中的TILs变化

a.  初步确定好标志物组合后，需要找到合适的抗体。选择一抗时，推荐适用于免疫组化的单克隆抗体。每一个新的抗体，都需要进行免疫组化IHC验证抗体特异性、与预设荧光通道匹配的的单色免疫荧光染色验证荧光通道匹配度，多重免疫荧光初步测试验证在抗体组合中抗体染色特异性是否与免疫组化结果一致。

验证抗体染色特异性

b.  优化多重荧光免疫组化方案。优化测定的关键性能参数有信号强度、信号平衡、标记独立性、染色均匀性以及随时间的重现性。对于临床研究而言，除上述要点外，更重要的是整体方案是否具有良好的稳定性、定量准确性、是否可以在多个实验室间平行迁移。

通过 inForm测量，所有 Opal 荧光团信号强度的目标范围定量值在10-30内，除了 Opal Polaris 780，其推荐的范围是1-10。这些范围支持可靠和准确的数据分析，保证各通道之间信号相对均衡，不易引起通道间信号的相互干扰。值得注意的是，当信号低至几个计数或高至50个或更多计数时，仍然可以获得数据，但串扰问题的风险更高。

30张连续切片定量评估染色的稳定性、有效检测范围、信噪比

我们推荐的评估方法是通过将前20个信号最强细胞的信号平均值除以信号最弱的10%细胞的信号平均强度来计算信号背景比(SNR)。10或更高的信噪比可支持可靠的图像分析，准确计数阳性细胞和量化表达水平。

对于经典Opal 染料(520,540,570,620,650和690) ，经验法则是相邻通道之间的信号比为3:1或更低。该规则对于520、540和570通道特别有用。大多数情况下，当比值超过3时，测定结果表现良好，串扰可以忽略不计。随着 MOTiF 6-plex的开发，我们推出了Opal 480 和Opal 780，拓宽了可选染料覆盖的光谱范围，在增加染料选择的同时，降低了通道之间信号平衡的难度，光谱拆分后基本没有相邻通道的残余信号。

串色干扰应该被最小化或消除，因为它可能导致假阳性，限制重要标志物的有效检测范围，导致邻近通道信号的不准确。串扰有两个主要来源: (1)不同原理成像设备的影响：由于不完善的滤光片或串扰补偿算法不足而导致荧光信号从一个通道泄漏到另一个通道; (2)来自荧光团的染色串扰：荧光染料不准确地标记样品上的蛋白分子，导致残余荧光团与其他荧光团标记的表位结合。区分这两个原因非常重要，因为解决每个原因都是非常不同的过程。

串色可以通过一组荧光单染样本来评估，每张载玻片对应一个Opal染料，结合光谱成像、光谱拆分算法，提取每个Opal染料通道中的信号，进行定量评估。对于稳健的分析，建议残余串扰小于1% ，以确保对图像分析的干扰最小。

光稳定性可确保分析的稳健性并支持最终临床应用，重要的是荧光信号不仅光稳定、并允许重复扫描，而且在时间上稳定，以便载玻片可以存储数月而不会明显丢失信号。使用Opal多重荧光染色的样本，可以在室温下存储，信号丢失小于10% ，在6个月的过程中可反复扫描。

完成上述步骤即可使用PhenoImager 多重荧光免疫组化技术，建立一个实用、可靠、可重复的蛋白标志物检测方案，更深入地询问肿瘤微环境中的复杂生物学，包括检测与临床结果相关的细胞-细胞空间相互作用，进行空表型分析，探索肿瘤免疫微环境的变化。

参考文献

1.Opal Multiplex IHC Assay Development Guide and Image Acquisition Information

2.Feng, Z. et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 3, 1–11 (2015).

3.Parra, E. R. et al. Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues. Scientific Reports 11, 4530 (2021).

4.Cascone, T. et al. Neoadjuvant nivolumab or nivolumab plus ipilimumab in operable non-small cell lung cancer: the phase 2 randomized NEOSTAR trial. Nature Medicine 1–11 (2021) doi:10.1038/s41591-020-01224-2.

5.Taube JM, Roman K, Engle EL, et al Multi-institutional TSA-amplified Multiplexed Immunofluorescence Reproducibility Evaluation (MITRE) Study Journal for ImmunoTherapy of Cancer  2021;9:  http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2020-002197

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