Nature | PhenoCycler阐释人肠道组织单细胞空间图谱，多维度解析细胞邻域

成人肠道系统由大约7米的小肠和2米的大肠组成。小肠具有表型异质性，包括三个形态不同的区域：十二指肠、空肠和回肠。大肠分为升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠区。

每一个解剖区域都包含表型和形态不同的细胞类型，如上皮细胞、基质细胞和免疫细胞，每种细胞类型都包括多种细胞亚型，尤其是免疫细胞特别令人感兴趣，因为它们与肠道中存在的微生物组和异物相互作用。尽管这些细胞类型在肠道系统中有些是广泛分布的，但某些已知的特定细胞类型会显示位置偏好。例如，潘氏细胞位于小肠组织内，肠道内分泌L细胞主要分布于回肠和大肠中。

此外，这些细胞类型在肠道中被组织成不同空间“邻域”，并且这些邻域的组成和潜在细胞类型的分子表型在这些解剖区域中以相对未知的方式变化。功能邻域的组成和构成这些邻域的细胞状态的分子特性的差异定义了人体肠道的组成和功能。

本研究联合使用单核RNA测序（snRNA-seq）、单核snATAC–seq测序以及PhenoCycler单细胞原位空间蛋白组学技术以单细胞分辨率绘制肠道的各个区域。既往研究已经使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定了细胞类型，并对整个肠道的细胞组成进行了分类。本次研究样本来自9例肠道供者的8个不同区域的样本：小肠的十二指肠、近端空肠、中段空肠和回肠，以及大肠的上升段、横段、下降段和乙状结肠区域。

通过54标PhenoCycler组织原位成像，发现从小肠到结肠，基质区域内的内皮细胞逐渐减少，平滑肌细胞逐渐增加（图1a）；而免疫浸润区域的CD8 T细胞在结肠减少，DC细胞有所增加（图1b）；在上皮区域，与小肠相比，结肠中的肠细胞减少，分泌性肠细胞（杯状细胞）核CD66+肠细胞增加，潘氏细胞消失（图1c）。

基于肠道组织中鉴定的25种细胞类型，进一步探讨了细胞类型与临床数据的关联。M1巨噬细胞水平与体重指数（BMI）的相关性最高（图1d），并仅限于粘膜层（图1e）。还观察到有高血压病史的供体中内皮细胞和CD8 T细胞显著减少（图1f）。

除了细胞类型组成外，细胞密度对于其发挥特定作用或进行特定的细胞间相互作用，也具有空间分布特异性。对各类细胞的密度分析表明，免疫细胞亚型沿肠道长度的空间限制具有重要作用，如粘膜层的浆细胞和CD8+ T细胞，肠道弥漫性分布的M2巨噬细胞等（图1g, 1h）。

图1 肠道组织的细胞组成和相对丰度分析

2.1 间质细胞邻域

为了提供细胞间相互作用、细胞密度和肠道整体多细胞结构的全局视图，研究人员采用细胞邻域（Cell Neighborhood）分析。这揭示了18个重要的多细胞结构，主要是基于上皮、基质和免疫的细胞邻域（图2a,b）。

有8个细胞邻域归类为间质邻域，并鉴定出肠道内的主要结构：微血管和大血管，神经支配的间质和平滑肌，以及间质和平滑肌区域内的先天免疫中枢（图2a）。从小肠到结肠，只有平滑肌邻域增加，而神经支配的平滑肌和先天免疫平滑肌区没有增加（图2e）。这进一步表明，这些致密的平滑肌细胞区域在结肠内增加。

图2  肠道组织的细胞邻域分析

2.2 免疫细胞邻域

在细胞邻域分析中也观察到浆细胞密度增加驱动的“浆细胞富集”邻域，与上述研究结果一致。该邻域也表现出与CD4+ T细胞和抗原提呈细胞（如DC细胞和巨噬细胞）的共同富集（图2a），并定位于粘膜固有层。

值得注意的是，尽管CD8+ T细胞在肠道中的密度相对较低，但它们在两个主要邻域中富集，其中一个“富集CD8+ T细胞的IEL”（上皮内淋巴细胞）邻域，从小肠（30%）到小肠（3%）比例显著降低，与“浆细胞富集”邻域增加相对应。CD4+ T细胞促成了5个不同的多细胞社区（图2a）。考虑到CD4+ T细胞协调先天和适应性免疫反应，CD4+ T细胞、B细胞和DC细胞成员定义了两种不同的卵泡基础结构。肠道内滤泡邻区与外卵泡邻域比值的变化表明肠道内存在连续的淋巴组织。

细胞邻域的多细胞组成的变化可能表明核心功能以及基于解剖位置的组成灵活性的需要。研究人员比较了小肠和结肠中所有邻域的细胞类型组成，发现内外滤泡结构都不太保守，而基质区则更保守。对富含早期上皮祖细胞的 “潘氏细胞富集”邻域等分析可能表明肠道中不同的隐窝微环境。

2.3 肠道隐窝邻域

当观察到邻域细胞类型保守性的差异时，研究人员分别对肠道的每个单独区域进行邻域分析，然后将结果连接起来。识别所有聚合的邻域（图2a），并确定了两个独特的邻域：“神经内分泌富集”邻域，仅在结肠中发现，代表了结肠隐窝区，定位于黏膜肌层附近（图2c-f），以及“中性粒细胞富集”邻域，分布在整个肠道中，但在结肠中富集（图2c）。富含中性粒细胞的邻域特征是与血管系统和先天免疫细胞相关的高密度中性粒细胞，通常在基质和平滑肌区域内发现。富含神经内分泌的邻域富含上皮细胞和免疫细胞类型的混合物。

多细胞邻域分析揭示了整个肠道的结构组成以及这些邻域组成的关键差异，特别是与适应性免疫系统和肠隐窝有关。然而，这些多细胞邻域如何相互作用，以及它们如何构成空间组织尚不清楚。了解多细胞结构的相互作用是定义组织层次结构以及定义关键功能组织交界的关键。

研究人员试图采用多种方法研究高阶结构组织：从细胞类型（Cell type）到细胞邻域（Neighbourhood）、邻域群落（Community），再到组织单元（Tissue unit）。首先，以类似于聚类细胞类型（图3a）窗口的方式聚类邻域（图3b）组成窗口。这产生了邻域群落（图3c），然后利用它来识别主要的组织单位（图3d），如肌层粘膜。“潘氏细胞富集”邻域在“适应性免疫富集邻域群落”中富集。事实上，围绕“潘氏细胞富集”邻域的同心邻域环境也显示出与外滤泡和“适应性免疫”富集邻域共定位。这些结果支持适应性免疫系统与肠隐窝形成保守生态位的观点。

图3 肠道组织的空间多层分级结构

为了将各个层次的空间组织联系起来，研究人员创建了一个层级结构网络图（图3e）。这个图表的每一层都是由其主要贡献者连接到下一层的。利用这种直观的形式可以观察到肠细胞和组织结构的多个层次。邻域群落的可视化还揭示了肠道的空间分层，从平滑肌到基质，尤其是上皮区域内移动（图3f）。为了对这些社区间的空间互作可视化，还创建了一个空间地图，揭示了结肠组织内邻域群落之间的主要结构关系（图3g）。总之，这些结果表明，富含免疫细胞的邻域在肠道组织组织中具有重要作用。分层映射数据进一步证实了小肠和结肠之间多细胞结构的组成差异，但也突出了保守的多细胞结构相互作用和不同细胞类型在肠道亚区的重要分布。

PhenoCycler空间蛋白组分析可以检查每个细胞邻域或社区中富集的细胞-细胞对。使用相同的方法来计算滤泡邻域群落中的细胞-细胞共定位，共识别了57对共定位的细胞对，每对细胞都包含大量潜在的受体-配体相互作用。为了更全面地描述邻域内潜在的相互作用和表达，在单细胞水平上整合PhenoCycler和snRNA-seq数据，显示出一致的RNA/蛋白表达模式，表明整合性能良好（图4）。利用这种整合，计算了先前Phenocycler定义的细胞邻域中具有配对连锁转录组信息的差异表达基因。因此，整合PhenoCycler和snRNA-seq数据揭示了与不同细胞邻域相关特定表达模式。