文献解读 | 利用单细胞转录组测序解析睾丸生精微环境的正常发育与病理变化
文章名称：Single-cell analysis of developing and azoospermia human testicles reveals central role of Sertoli cells
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2020年11月
影响因子：12.121
—— 摘要 ——
目前，对非梗阻性无精症（NOA）发病机制和正常生精微环境的不完全了解限制了针对1％男性的非阻塞性无精子症（NOA）治疗的临床疗效。在这里，我们分析了来自10个健康供体的> 80,000人睾丸单细胞转录组（其范围从婴儿到成人）以及7位NOA患者。结果显示，在睾丸微环境中形成支架的Sertoli细胞在NOA患者中受到严重破坏，并确定Sertoli细胞成熟的路线图。值得注意的是，患有先天性疾病（克氏综合征和Y染色体微缺失）的患者的支持细胞已经成熟，但表现出异常的免疫反应，而特发性NOA（iNOA）中的细胞在生理上还不成熟。此外，我们发现抑制Wnt信号会促进iNOA患者的Sertoli细胞成熟，从而使这些细胞恢复其支持生殖细胞存活的能力。我们为NOA的诊断方法和治疗目标的发展提供了新颖的视角。
—— 材料与方法 ——
材料：10例不同年龄生精正常的睾丸样本和7例不同病理类型NOA患者睾丸样本。
方法：10x Genomics的高通量单细胞转录组测序。
—— 研究结果 ——
1.生精正常和NOA患者睾丸中细胞亚群分析
研究者从10名生精正常样本（2-31周岁，样本来自于良性睾丸肿瘤等手术捐献组织）和7名NOA患者（3例克氏综合征、1例Y染色体微缺失和3例特发性NOA，来自显微取精手术剩余组织）共获得88723个睾丸细胞，每个细胞平均检测到2719个基因。UMAP分析显示，不同年龄组的基因表达具有明显的异质性，但5个生精正常患者样本具有良好的重复性（图1b）。进而，作者在10个生精正常的样本中，鉴定出9个不同的细胞亚群，分为生殖细胞和微环境体细胞两部分（图1c）。对10个生精正常供体样本分别与Y染色体微缺失、克氏综合征和特发性NOA患者的睾丸单细胞数据进行聚类分析发现，正常成人和3种NOA患者之间的支持细胞的转录状态发生显著的改变（图1d-g）。
图1：用单细胞RNA-seq分析人类睾丸细胞从婴儿期到成年期和NOA患者的整体表达谱
2. 睾丸支持细胞在成熟过程中的发育机制
为了探究人睾丸支持细胞在正常发育过程中的发育机制，作者对10个生精正常供体的支持细胞进行重聚类和拟时序分析，并鉴定到3个连续且独立的发育阶段，更新了原来支持细胞只有成熟和不成熟两种状态的认知（图2a,b）。结合不同年龄段供体样本分析发现，支持细胞在幼龄时开始向成熟期发育，在青春期后期发育至稳定状态（图2c）。进一步分析各阶段基因表达模式的动态变化，作者筛选出了不同时期的特征基因，并通过免疫组化在蛋白表达层面进行验证（图2d-f）。后续通过细胞功能的分析阐述了睾丸支持细胞在发育过程中增殖、代谢、结构重塑和信号分泌等多方面的动态变化，这些变化与生殖细胞在精子发生各阶段的需求紧密关联，说明睾丸支持细胞在生精微环境中的重要性。
图2：支持细胞发育的三个成熟阶段的鉴定
3. 睾丸支持细胞发育过程中的调控通路
372个候选调控子的拟时序轨迹的分支节点上显示出显著变化（图3a）。通过GO分析，表明类固醇激素是主要的上游细胞外调控信号之一（图3b,c）。IPA分析结果表明，睾丸支持细胞的增殖主要发生于第一阶段，结构重塑发生在第二阶段（图3d,e）。作者通过分析1665个人类转录因子的调控网络和其下游基因集发现，FOSB,EGR3,KLF10等基因在第一阶段发挥重要的作用，在第二和第三阶段的主要调控因子分别为HMGB1,SUB1,CNBP MEF2C,ZFP36L2,NFIX和RORA,SMARCA1,HOPX（图3f-k）。
图3：推测睾丸支持细胞3个阶段的信号通路和关键调控子
4. 生精微环境的复杂动态网络
为了研究生精环境中复杂的信号网络及其动态变化，作者对睾丸细胞亚群进行了配体-受体分析，发现支持细胞与其他细胞亚群存在大量的相互作用，且这些互作关系随着睾丸发育也在不断发生变化。该成果首次绘制了人类生精微环境成熟过程中复杂的旁分泌调节网络图谱（图4a-h）。
图4：睾丸支持细胞与其他细胞相互作用的动态变化
5. 不同类型NOA睾丸支持细胞具有不同的病理特征
此外，作者还补充了病理状态下的生精微环境变化，作者结合了正常发育样本与3种NOA样本进行分析。结果表明3种NOA患者的支持细胞基因表达特征与正常成年人均有显著差异，其中，特发性NOA支持细胞与正常未成熟的支持细胞表达很相似，表现为生理性不成熟的特点；而另外两类NOA支持细胞则表现为以异常炎症反应和激素紊乱为主的病理状态。此外，一些其他的调控子在NOA和正常支持细胞之间表达有所不同（图5a-g）。
图5：三种NOA支持细胞的单细胞转录组分析
6. 特发性NOA睾丸支持细胞成熟障碍的相关通路分析
作者进一步研究了特发性NOA睾丸支持细胞成熟的异质性、增殖能力及其调控网络。来自5个生精正常和3个特发性NOA患者支持细胞的UMAP图显示，这些支持细胞可以聚类成3个细胞亚群（图6a）。拟时序轨迹分析显示，特发性NOA支持细胞的成熟特征与早期两个发育阶段相似（图6b）。两类样本之间的差异基因和GSEA分析均表明了NOA睾丸支持细胞的异质性与谱系退化，并且有数据表明Wnt通路的持续激活可能是导致其成熟障碍的主要原因（图6c-h）。
通过对比三种抑制剂在支持细胞中Wnt通路的抑制效果，作者选用ICG-001（ICG）进行后续研究（图7a-d）。在体外培养的支持细胞中加入ICG，2周后，作者发现一些支持细胞的成熟特征基因发生了显著变化，包括第一阶段的特异性基因FOSB,EGR3,JUN表达下调，而第三阶段的HOPX,TSC22D1表达上调（图7e-i）。此外，与精原细胞共培养实验结果表明，诱导成熟的支持细胞能够更好的维持精原细胞的存活（图7j-k）。
图6 表达模式的改变显示了特发性NOA 支持细胞的异质性和成熟缺陷
图7 抑制Wnt通路可诱导睾丸支持细胞在体外发育
—— 结论 ——
本文阐述了睾丸生精微环境发育的细胞发育路径。通过定义睾丸生精微环境的细胞亚群，揭示了不同细胞类型之间的复杂互作关系。通过对不同年龄段供体睾丸支持细胞的单细胞转录组测序数据分析，研究了睾丸生精微环境的发育过程。
作者还通过系统的比较生精正常患者和NOA患者的生精微环境在不同阶段支持细胞的特征基因的表达差异发现了特发性NOA支持细胞谱系退化的特点，鉴定了Wnt通路可以作为诱导支持细胞发育的潜在治疗靶点。这些发现为后续进一步揭示睾丸发育过程、研究NOA的发病机制和有效干预治疗方法打下了良好的理论基础。
